Рестрикционен ензим

Од Википедија — слободната енциклопедија
Прејди на прегледникот Прејди на пребарувањето

Рестрикционен ензим, рестрикциона ендонуклеаза, или рестриктаза е ензим кој ја сече ДНК молекулата на фрагменти, на или во близина на специфични места кои ги препознава, наречени рестрикциони места.[1][2][3] Рестрикционите ензими спаѓаат во групата на eндонуклеази. Рестрикционите ензими најчесто се класифицираат во пет типови, кои се разликуваат во однос на нивната структура и во однос на тоа дали го сечат ДНК супстратот точно на местото кое го препознаваат или на друго место кое не е исто со местото на препознавање. За да ја пресечат ДНК, сите рестрикциони ензими прават два засеци, секој на една од веригите на двојниот хеликс.

Овие ензими се среќаваат во бактериите и aрхеите и се дел од одбранбениот механизам на клетката против вируси.[4][5] Во внатрешноста на прокариотската клетка, рестрикционите ензими селективно ја сечат страната ДНК во процес кој се нарекува рестрикциона дигестија; во исто време, ДНК на домаќинот е заштитена со помош на модификациски ензим (метилтрансфераза) кој врши модификација на прокариотската ДНК за да ја заштити од дејството на рестрикционите ензими. Заедно, овие два процеса го формираат рестрикционо-модификациониот систем.[6]

Досега се проучени во детали над 3000 рестрикциони ензими, а повеќе од 600 од нив се достапни комерцијално.[7] Овие ензими рутински се користат за модификација на ДНК во лабораториите, и тие се важна алатка во молекуларното клонирање.[8][9][10]

Место на препознавање[уреди | уреди извор]

Палиндромското место на препознавање се чита на ист начин и на двете вериги кога се чита во иста насока.

Рестрикционите ензими препознаваат одредена секвенца на нуклеотиди[2] и создаваат пресек на двете вериги на ДНК. Секвенците кои ги препознаваат можат да бидат класифицирани врз основа на бројот на базите во секвенцата, кој најчесто изнесува помеѓу 4 и 8. Бројот на базите во секвенцата утврдува колку често тоа место случајно би се појавувало во даден геном, на пример, секвенца од 4 бази теоретски би се појавувала еднаш на секои 4^4 = 256 базни парови (бп), секвенца од 6 бази еднаш на секои 4^6 = 4096 бп, а секвенца од 8 бази еднаш на секои 4^8 = 65.536 бп.[11] Многу од овие секвенци се палиндроми, што значи дека се читаат на ист начин и во двете насоки (напред и назад).[12] Во ДНК можат да се јават два типа на палиндромски секвенци. Огледалниот палиндром е сличен на оној кој се среќава во обичниот текст, во кој една секвенца се чита на ист начин напред и назад, како што е, на пример, GTAATG. Палиндромот на превртено повторување исто така се чита исто напред и назад, но овде секвенците се наоѓаат на спротивните, комплементарни нишки (односно, кај двоверижна ДНК), како што е, на пример, GTATAC (GTATAC е комплементарна на CATATG).[13] Палиндромите на превртено повторување се почести и имаат поголема биолошка значајност од огледалните палиндроми.

Сечењето кое го врши ензимот EcoRI создава „лепливи краеви“,

EcoRI restriction enzyme recognition site.svg

додека сечењето кое го врши ензимот SmaI создава „тапи краеви“:

SmaI restriction enzyme recognition site.svg

Секвенците на препознавање на ДНК се разликуваат за секој рестрикционен ензим, па поради тоа има разлики во должината, секвенцата и ориентацијата (5' крај или 3' крај) на протрудирачките лепливи краеви кои ги создава ензимот.[14]

Типови[уреди | уреди извор]

Рестрикционите ендонуклеази кои се среќаваат во природата се категоризирани во четири групи (тип I, тип II, тип III и тип IV) врз основа на нивниот состав, ензимскиот кофактор кој го користат, природата на нивната целна секвенца и позицијата на местото на ДНК кое го сечат во однос на целната секвенца.[15][16][17] Меѓутоа, анализите на ДНК секвенците на рестрикционите ензими покажуваат поголеми варијации, што сугерира дека постојат повеќе од четири типа.[18] Сите типови на рестрикциони ензими препознаваат специфични кратки ДНК секвенци и вршат ендонуклеолитичко сечење на ДНК чиј продукт се специфични фрагменти со терминални 5'-фосфати. Тие се разликуваат по секвенцата која ја препознаваат, составот на подединиците, позицијата за сечење и кофакторот кој го користат:[19][20]

  • Тип I ензимите (EC 3.1.21.3) сечат место кое е далеку од местото на препознавање; како кофактори користат ATP и S-aденозил-L-метионин; тие се мултифункционални протеини кои делуваат и како рестрикциони ензими и како метилази (EC 2.1.1.72).
  • Тип II ензимите (EC 3.1.21.4) сечат место кое е во рамките или на одредено кратко растојание од местото на препознавање; повеќето користат магнезиумов јон како кофактор; имаат функција само на рестрикциони ензими.
  • Тип III ензимите (EC 3.1.21.5) сечат место кое е на кратко растојание од местото на препознавање; користат ATP (но не го хидролизираат); S-aденозил-L-метионинот ја поттикнува реакција, но не е неопходен; постојат како дел од комплекс со модификациона метилаза (EC 2.1.1.72).
  • Тип IV ензимите ја таргетираат модифицираната ДНК, на пример, метилирана, хидроксиметилирана и гликозил-хидроксиметилирана ДНК.

Номенклатура[уреди | уреди извор]

Изведување на името EcoRI
Кратенка Значење Опис
E Escherichia род
co coli вид
R RY13 сој
I Прв идентификуван редот по кој се идентификувани во бактеријата

Од нивното првично откривање во 1970-тите години, многу рестрикциони ензими биле идентификувани; на пример, карактеризирани се повеќе од 3500 различни тип II рестрикциони ензими.[21] Секој ензим е именуван по бактеријата од која бил изолиран, со употреба на систем за именување кој се базира на бактерискиот род, вид и сој.[22][23]

Употреба[уреди | уреди извор]

Изолираните рестрикциони ензими се користат за манипулирање со ДНК молекули за различни научни цели.

Тие се користат за да се овозможи вметнување на гени во плазмидните вектори за време на експериментите на клонирање на гени и производството на белковини.[24][25]

Рестрикционите ензими може да се користат и за разликување на генските алели со специфично препознавање на единечни базни промени во ДНК познати како еднонуклеотидни полиморфизми.[26][27] Ова е можно само ако еднонуклеотидниот полиморфизам го промени рестрикционото место присутно во алелата. Со овој метод, рестрикциониот ензим може да се користи за да се генотипизира ДНК без употреба на скапо генско секвенционирање.

На сличен начин, рестрикционите ензими се користат за дигестија на геномската ДНК за анализирање на гени со Southern blot. Оваа техника им овозможува на истражувачите да идентификуваат колку копии (или паралози) на генот се присутни во геномот на една индивидуа, или колку генски мутации (полиморфизми) се присутни во дадена популација.[28]

Вештачките рестрикциони ензими создадени со поврзување на FokI доменот за сечење на ДНК со низа на ДНК врзувачки протеини или низи од цинкови прсти, наречени цинкови прсти нуклеази (ZFN), се моќна алатка за менување на геномот поради нивната голема специфичност за одредени секвенци.

Поврзано[уреди | уреди извор]

Наводи[уреди | уреди извор]

  1. Restriction endonucleases. „CRC Critical Reviews in Biochemistry“ том  4 (2): 123–64. ноември 1976 г. doi:10.3109/10409237609105456. PMID 795607. 
  2. 2,0 2,1 Specificity of restriction endonucleases and DNA modification methyltransferases a review (Edition 3). „Gene“ том  92 (1-2): 1–248. август 1990 г. doi:10.1016/0378-1119(90)90486-B. PMID 2172084. 
  3. Burrell M, уред (1993). „Chapter 8: Restriction Enzymes“. Enzymes of Molecular Biology. Methods of Molecular Biology. 16. Totowa, NJ: Humana Press. стр. 107–200. ISBN 0-89603-234-5. 
  4. DNA modification and restriction. „Annual Review of Biochemistry“ том  38: 467–500. doi:10.1146/annurev.bi.38.070169.002343. PMID 4897066. 
  5. Bacteriophage survival: multiple mechanisms for avoiding the deoxyribonucleic acid restriction systems of their hosts. „Microbiological Reviews“ том  47 (3): 345–60. септември 1983 г. PMID 6314109. 
  6. Behavior of restriction-modification systems as selfish mobile elements and their impact on genome evolution. „Nucleic Acids Research“ том  29 (18): 3742–56. септември 2001 г. doi:10.1093/nar/29.18.3742. PMID 11557807. 
  7. REBASE--enzymes and genes for DNA restriction and modification. „Nucleic Acids Research“ том  35 (Database issue): D269-70. јануари 2007 г. doi:10.1093/nar/gkl891. PMID 17202163. 
  8. Principles of gene manipulation: an introduction to genetic engineering. Oxford: Blackwell Scientific. 1994. ISBN 0-632-03712-1. https://archive.org/details/principlesofgene00oldr. 
  9. Laboratory DNA science: an introduction to recombinant DNA techniques and methods of genome analysis. Menlo Park, Calif: Benjamin/Cummings Pub. Co. 1996. ISBN 0-8053-3040-2. 
  10. Recombinant DNA and Biotechnology: A Guide for Students. Washington, D.C: ASM Press. 2001. ISBN 1-55581-176-0. 
  11. Restriction Map
  12. Structure and function of type II restriction endonucleases. „Nucleic Acids Research“ том  29 (18): 3705–27. септември 2001 г. doi:10.1093/nar/29.18.3705. PMID 11557805. 
  13. Clark DP (2005). Molecular biology. Amsterdam: Elsevier Academic Press. ISBN 0-12-175551-7. 
  14. The molecular perspective: restriction endonucleases. „Stem Cells“ том  20 (2): 190–1. doi:10.1634/stemcells.20-2-190. PMID 11897876. http://theoncologist.alphamedpress.org/content/7/1/82.full.pdf. 
  15. Biology of DNA restriction. „Microbiological Reviews“ том  57 (2): 434–50. јуни 1993 г. PMID 8336674. PMC: 372918. http://mmbr.asm.org/cgi/pmidlookup?view=long&pmid=8336674. 
  16. DNA restriction and modification mechanisms in bacteria. „Annual Review of Microbiology“ том  25: 153–76. doi:10.1146/annurev.mi.25.100171.001101. PMID 4949033. 
  17. Structure and mechanism of multifunctional restriction endonucleases. „Annual Review of Biochemistry“ том  50: 285–319. doi:10.1146/annurev.bi.50.070181.001441. PMID 6267988. 
  18. Types of Restriction Endonucleases | NEB
  19. S-Adenosyl-L-methionine-dependent restriction enzymes. „Critical Reviews in Biochemistry and Molecular Biology“ том  39 (1): 1–19. doi:10.1080/10409230490440532. PMID 15121719. 
  20. Restriction endonucleases: classification, properties, and applications. „Molecular Biotechnology“ том  23 (3): 225–43. март 2003 г. doi:10.1385/MB:23:3:225. PMID 12665693. 
  21. A. Pingoud (2004). Restriction Endonucleases (Nucleic Acids and Molecular Biology). Springer. стр. 3. ISBN 9783642188510. https://books.google.com/books?id=i-HwCAAAQBAJ&pg=PA3&lpg=PA3#v=onepage&q&f=false. 
  22. Letter: A suggested nomenclature for bacterial host modification and restriction systems and their enzymes. „Journal of Molecular Biology“ том  81 (3): 419–23. декември 1973 г. doi:10.1016/0022-2836(73)90152-6. PMID 4588280. 
  23. A nomenclature for restriction enzymes, DNA methyltransferases, homing endonucleases and their genes. „Nucleic Acids Research“ том  31 (7): 1805–12. април 2003 г. doi:10.1093/nar/gkg274. PMID 12654995. 
  24. Geerlof A. „Cloning using restriction enzymes“. European Molecular Biology Laboratory - Hamburg. конс. 2008-06-07. 
  25. Molecular cloning: a laboratory manual. Cold Spring Harbor, N.Y: Cold Spring Harbor Laboratory. 2001. ISBN 0-87969-576-5. 
  26. Combining allele-specific fluorescent probes and restriction assay in real-time PCR to achieve SNP scoring beyond allele ratios of 1:1000. „BioTechniques“ том  44 (2): 193–4, 196, 199. февруари 2008 г. doi:10.2144/000112719. PMID 18330346. 
  27. SNP Cutter: a comprehensive tool for SNP PCR-RFLP assay design. „Nucleic Acids Research“ том  33 (Web Server issue): W489-92. јули 2005 г. doi:10.1093/nar/gki358. PMID 15980518. 
  28. Biochemistry (Fifth издание). San Francisco: W.H. Freeman. 2002. стр. 122. ISBN 0-7167-4684-0. 

Надворешни врски[уреди | уреди извор]

Општи информации:

Бази на податоци:

Софтвер: