Хромозомско скокање
Хромозомското скокање е алатка на молекуларната биологија која се користи во физичкото мапирање на геномите. Поврзано е со неколку други алатки кои се користат за истата намена, заедно со хромозмското одење.
Хромозомското скокање се користи за да се заобиколат областите кои тешко се клонираат, како што се оние што содржат повторувачка ДНК, кои не можат лесно да се мапираат со хромозомско одење, и е корисно за брзо движење по хромозомот во потрага по одреден ген. За разлика од хромозомското одење, хромозомското скокање може да започне во една точка од хромозомот со цел да се помине потенцијалната далечна точка на истиот хромозом без клонирање на интервентните секвенци.[1] Краевите на еден голем фрагмент на ДНК се целниот дел за клонирање на хромозомот што скока, додека средниот дел се отстранува со секвенци на хемиски манипулации пред чекорот на клонирање.[2]
Процес[уреди | уреди извор]
Хромозомското скокање овозможува да се клонираат два краја на секвенцата на ДНК без средниот дел. Геномската ДНК може делумно да се вари со помош на рестриктивна ендонуклеаза и со помош на ДНК лигаза, фрагментите се кружат при мала концентрација.[2][3] Од познати низи, прајмер е дизајниран да се секвентира низ кружниот спој. Овој прајмер се користи за прескокнување на интервали од 100 kb-300 kb: секвенца оддалечена 100 kb би се приближила до познатата низа при циркуларизација, тој дозволува скокање и секвенционирање на алтернативен начин. Така, секвенците кои не се достапни со хромозомското одење може да се секвенционираат.[2] Хромозомското одење може да се користи и од новата позиција на скок (во која било насока) за да се бараат секвенци слични на ген, или може да се користат дополнителни скокови за да напредува понатаму по хромозомот. Комбинирањето на скокање на хромозомот до хромозомот што поминува низ хромозомот овозможува заобиколување на повторувачката ДНК за пребарување на целниот ген.
Библиотека[уреди | уреди извор]
Хромозомска библиотеката за скокање се разликува од хромозомското одење поради манипулациите извршени пред клонирањето. Со цел да се конструира хромозомската библиотека за скокање, треба да се идентификуваат поединечни клонови од случајни точки во геномот (општи библиотеки за скокање, прв основен протокол) или од крајот на специфичните фрагменти за ограничување (специфичен алтернативен протокол за библиотеки за скокање).[1][4]
ДНК сварена со Нотл[уреди | уреди извор]
Еден пример за изградба на библиотека е класифицирана како рестриктивна ендонуклеаза со ретко сечење, како што е Нотл.[5][6] Со цел да се конструира и карактеризира библиотека базирана на човечка ДНК сварена со Нотл, случајните клонови биле анализирани со рестриктивно мапирање.[3] Поради широката дистрибуција на големини на фрагменти направени со целосното варење со Нотл, библиотеката била конструирана во две фракции, ниска и висока плазмидна концентрација.[3] Клоновите кои поседувале уникатни крајни фрагменти потоа биле анализирани со хибридизација со пулсното поле на градиент (PFG) Јужна дамка.[3] Испитувајќи ги резултатите собрани за еднократно и двојно дигестирање на човечка ДНК со ензимите Нотл, БссХлл и Нрул, создадена е мапа на ограничување со регион од 850 kb што ги содржи поврзувачките и скокачките клонови.[3] Понатаму, Нотл фрагменти од скокови од 250 и 350 kb биле евидентни во двата крајни клонови добиени што одговараат на генетски растојанија од 0,25 и 0,35 cm.[3]
Предности и недостатоци[уреди | уреди извор]
Предностите на хромозомското скокање се:
- Овозможува побрзо движење низ геномот во споредба со другите техники, како што е хромозомското одење.[1]
- Може да патува низ хромозомските региони кои содржат неклонирани секвенци кај бактериските домаќини.[1]
- Трето, оваа техника може да се користи за генерирање на геномски маркери со познати хромозомски локации.[1]
- Комбинацијата на скокање и поврзување на библиотеките за скокање со одење нуди можност за насочно одење и може да овозможи анализа на подолги региони во паралелни стратегии за мапирање.[3]
- Ја намалува сложеноста на библиотеките што треба да се прегледаат и конструираат од геном на цицачи.[3]
Сепак, и покрај овие предности, хромозомското скокање сè уште е ограничено поради капацитетот на векторот за клонирање што е растојанието на краевите на двата фрагменти што може да биде околу стотици килобази.[2] Дополнително, бидејќи скокот не ја клонира интервентната ДНК, ќе треба да се направи хромозомско одење за да се идентификуваат сите гени присутни во ДНК.[7] Сепак се смета дека е корисно поради можноста да се прескокнат над сто килобази во споредба со хромозомското одење.
Апликации[уреди | уреди извор]
Генетски нарушувања[уреди | уреди извор]
Библиотеките за хромозомско скокање помагаат во решавањето на компликацијата на стандардните техники на клонирање со големи молекуларни растојанија. Овој процес овозможува можност да се користи библиотеката за хромозомкото скокање за други генетски нарушувања за кои се потребни скокови од 100 килобази.[4] Особено за генетски нарушувања како што е цистичната фиброза, неговиот ген се наоѓа во човечкиот хромозом 7, може да ја искористи библиотеката за хромозомско скокање за да бара скокачки клон, сретнат онкоген.[4] Идентификацијата на цистичната фиброза била комплицирана поради тоа што постои во еукариотските гени кои се составени со кодирање (екзони) и некодирачки (интрони) сегменти, каде што интроните се мали по големина што ги отежнува откривањето.[7] Друга борба во препознавањето на генот за цистична фиброза е затоа што клетките на цицачите содржат разновидна повторлива ДНК што може да доведе до неправилно клонирање и блокирање на репликацијата на ДНК и може да предизвика нестабилност.[8] Овие две компликации, традиционалните техники на клонирање не се во можност да се обработат бидејќи голем принос на егзони би требало да биде видлив за да се произведе сигнал за идентификување на генот за цистична фиброза и ДНК ќе мора да биде ослободена од какви било повторливи елементи.[7]
Наводи[уреди | уреди извор]
- ↑ 1,0 1,1 1,2 1,3 1,4 „Construction of chromosome jumping and linking libraries in E. coli“. Current Protocols in Human Genetics. 1 (1): 5.4.1–5.4.17. May 2001. doi:10.1002/0471142905.hg0504s01. PMID 18428292.
- ↑ 2,0 2,1 2,2 2,3 „Jumping libraries and linking libraries: the next generation of molecular tools in mammalian genetics“. Trends in Genetics (англиски). 2: 174–179. January 1986. doi:10.1016/0168-9525(86)90219-2. ISSN 0168-9525.
- ↑ 3,0 3,1 3,2 3,3 3,4 3,5 3,6 3,7 „Construction and use of human chromosome jumping libraries from NotI-digested DNA“. Nature. 325 (6102): 353–355. January 1987. Bibcode:1987Natur.325..353P. doi:10.1038/325353a0. PMID 3027567.
- ↑ 4,0 4,1 4,2 „Construction of a general human chromosome jumping library, with application to cystic fibrosis“. Science. 235 (4792): 1046–1049. February 1987. Bibcode:1987Sci...235.1046C. doi:10.1126/science.2950591. PMID 2950591.
- ↑ „Overabundance of rare-cutting restriction endonuclease sites in the human genome“. Nucleic Acids Research. 15 (3): 1173–1184. February 1987. doi:10.1093/nar/15.3.1173. PMC 340516. PMID 3029699.
- ↑ Gerstein AS (2004-04-07). Molecular Biology Problem Solver: A Laboratory Guide (англиски). John Wiley & Sons. ISBN 978-0-471-46103-6.
- ↑ 7,0 7,1 7,2 „The search for the cystic fibrosis gene“. The American Journal of Physiology. 257 (2 Pt 1): L47–L52. August 1989. doi:10.1152/ajplung.1989.257.2.l47. PMID 2669523.
- ↑ Madireddy A, Gerhardt J (2017). „Replication Through Repetitive DNA Elements and Their Role in Human Diseases“. DNA Replication. Advances in Experimental Medicine and Biology. 1042. стр. 549–581. doi:10.1007/978-981-10-6955-0_23. ISBN 978-981-10-6954-3. PMID 29357073.