Нуклеаза

Од Википедија — слободната енциклопедија
Прејди на прегледникот Прејди на пребарувањето
Приказ на рестрикциониот ензим (ендонуклеаза) HindIII како сече двоверижна ДНК молекула на рестрикционо место (5'–A|AGCTT–3').

Нуклеаза (порано позната како нуклеодеполимераза или полинуклеотидаза) е ензим кој врши сечење на фосфодиестерската врска помеѓу нуклеотидите на нуклеинските киселини. Нуклеазите може да создадат едноверижни или двоверижни пресеци во целните молекули на нуклеинските киселини. Во живите организми, тие се од суштинско значење во многу аспекти на поправката на ДНК молекулите. Дефектите во структурите на одредени нуклеази може да предизвика генетска нестабилност или имунодефициенција.[1] Нуклеазите исто така често се користени во молекуларното клонирање.[2]

Постојат две основни класификации на нуклеазите врз основа на центарот на активност. Егзонуклеазите ги разградуваат краевите на молекулите на нуклеинските киселини. Ендонуклеазите вршат сечење во средината на целните молекули на нуклеинските киселини. Тие дополнително можат да се поделат на деоксирибонуклеази (делуваат на ДНК) и рибонуклеази (делуваат на РНК).[2]

Нумерички систем на класифицирање[уреди | уреди извор]

Повеќето нуклеази се класифицирани од страна на Бројот на ензимската комисија на „Комитетот за номенклатура на Интернационалната унија за биохемија и молекуларна биологија“ како хидролази (ЕЗ-број 3). Тие припаѓаат на естеразите, кои се подгрупа во рамките на хидролазите (ЕЗ-број 3.1). Естеразите во кои припаѓаат нуклеазите се класифицирани со ЕС-броеви 3.1.11 - ЕС-број 3.1.31.

Препознавање на врзувачкото место[уреди | уреди извор]

Нуклеазата мора да се врзе за нуклеинската киселина пред да може да ја пресече молекулата. Ова значи дека ензимот треба да биде способен да го препознае своето место на врзување. Постојат неспецифични и специфични начини на врзување на нуклеазите за нуклеинските киселини. И двата начина играат значајни улоги во живите организми, особено во поправката на ДНК.[3]

Неспецифичните ендонуклеази вклучени во поправката на ДНК може да ја скенираат ДНК молекулата за целни секвенци или оштетувања во нејзината структура. Овие нуклеази дифундираат по должината на ДНК додека не дојдат до целното место, по што следи интеракција помеѓу аминокиселинските остатоци од активното место на ензимот со хемиските групи на ДНК. Во случајот на ендонуклеазите како што се EcoRV, BamHI и PvuII, ова неспецифично врзување вклучува електростатски интеракции помеѓу минимална површина на протеинот и ДНК молекулата.

Специфичните нуклеази градат појаки врски со ДНК молекулата, така што таа навлегува длабоко во жлебот на ДНК-врзувачкиот домен на ензимот. Ова резултира со значителна деформација на терцијарната структура на ДНК и се остварува со површини богати со базни (позитивно наелектризирани) аминокиселински остатоци. Електростатската интеракција помеѓу ДНК и активното место на ензимот е екстензивна.[3]

Некои нуклеази кои се вклучени во процесот на поправка на ДНК покажуваат делумна специфичност кон одредени секвенци. Сепак, повеќето нуклеази кои се вклучени во процесот на поправка на ДНК се неспецифични, и се способни само за препознавање на структурни абнормалности во 'рбетот на ДНК, предизвикани од погрешно спарување на азотните бази.[3]

Нуклеази специфични за одредена секвенца[уреди | уреди извор]

Ензим Извор Секвенца која ја препознава Сече
HindII Haemophilus influenzae

5'–GTYRAC–3'

3'–CARYTG–5'

5'–GTY RAC-3'

3'–CAR YTG-5'

R = A или G; Y = C или Т

Постојат повеќе од 900 рестрикциони ензими, некои се специфични за одредени секвенци, а некои не се. Тие биле изолирани од над 230 видови на бактерии од првото откритие на HindII. Имињата на овие ензими го одразуваат нивното потекло—првата буква од името доаѓа од родот на бактеријата, а втората и третата буква од видот на кој таа припаѓа. На пример, EcoRI доаѓа од видот Escherichia coli RY13, додека HindII доаѓа од Haemophilus influenzae Rd. Броевите кои следат по името го означуваат редоследот по кој ензимите биле изолирани од дадениот сој на бактерии: EcoRI, EcoRII.

Ендонуклеази[уреди | уреди извор]

Рестрикционата ендонуклеаза функционира така што ја „скенира“ должината на ДНК молекулата. По пронаоѓање на своето специфично место на врзување (односно специфична секвенца), ендонуклеазата се врзува за ДНК молекулата и прави еден засек во пентозо-фосфатниот 'рбет на двете вериги. Позициите на овие две засеци, и во однос на едниот кон другиот, и во однос на секвенцата која ензимот ја препознава, се одредени од идентитетот на самата рестрикциона ендонуклеаза. Различни ендонуклеази прават различни засеци, но една одредена ендонуклеаза секогаш сече точно одредена секвенца на истиот начин, без разлика на која ДНК молекула делува. Резултатот на сечењето е фрагментирана ДНК молекула.

Назабени засеци[уреди | уреди извор]

Не сите рестрикциони ендонуклеази прават симетрични засеци, како погоре опишаната HindII. Многу ендонуклеази го сечат 'рбетот на ДНК во позиции кои не се директно спротивни една на друга. На пример, нуклеазата EcoRI има секвенца на препознавање 5'—GAATTC—3'.

Ензим Извор Секвенца која ја препознава Сече
HindIII Haemophilus influenzae
5'–AAGCTT–3'
3'–TTCGAA–5'
5'–A AGCTT-3'
3'–TTCGA A-5'
EcoRI Escherichia coli
5'–GAATTC-3'
3'–CTTAAG–5'
5'–G AATTC-3'
3'–CTTAA G-5'
BamHI Bacillus amyloliquefaciens
5'–GGATCC–3'
3'–CCTAGG–5'
5'–G GATCC-3'
3'–CCTAG G-5'

Кога ензимот ја препознава оваа секвенца, тој секоја од веригите ја сече помеѓу G и најблиската А. Откако засеците се направени, резултирачките фрагменти се држат заедно со релативно слаби водородни врски помеѓу комплементарните бази. Слабоста на овие врски овозможува ДНК фрагментите да се одделат еден од друг. Секој од двата фрагменти има протрудирачки 5' крај составен од неспарени бази. Други ензими создаваат пресеци во ДНК кои резултираат со протрудирачки 3' краеви. Ваквите протрудирачки краеви понекогаш се нарекуваат „лепливи краеви“, бидејќи тие имаат тенденција да се поврзат со комплементарни секвенци на бази. Со други зборови, ако неспарената секвенца 5'—AATT—3' се сретне со друга неспарена секвенца 3'—TTAA—5' тие ќе се поврзат една со друга—тие се „лепливи“ една за друга. Ензимот лигаза може да се искористи потоа за поврзување на пресеците во фосфатниот 'рбет. Ова својство на „лепливост“ овозможува создавање на рекомбинантни ДНК молекули, односно молекули кои се изградени од ДНК вериги кои потекнуваат од различни извори, што е основата на генетското инженерство.

Улога во природата[уреди | уреди извор]

Поправка на ДНК[уреди | уреди извор]

Многу нуклеази учествуваат во поправка на ДНК со препознавање на оштетените места и нивно отсекување. Овие ензими можат да функционираат самостојно или во комплекси. Повеќето нуклеази кои учествуваат во поправката на ДНК не се специфични за одредени секвенци. Тие ги препознаваат оштетените места на ДНК преку деформацијата на структурата на двојната верига.[4]

Коректура на репликацијата[уреди | уреди извор]

За време на репликацијата на ДНК, ДНК полимеразите вршат елонгација на новите ДНК вериги имајќи ги како образец старите комплементарни вериги. Повеќето ДНК полимерази имаат два различни ензимски домени: едниот домен има полимеразна активност, а другиот е егзонуклеаза која врши коректура. Полимеразата ја елонгира новата верига во насока 5' → 3'. Егзонуклеазата ги отстранува погрешно врзаните нуклеотиди од истата верига во насока 3' → 5'. Делециите кои ја деактивираат егзонуклеазата ја зголемуваат стапката на појава на мутации и со тоа стапката на морталитет кај афектираните организми.[5]

Стопирана репликациона вилушка[уреди | уреди извор]

Многу форми на оштетување на ДНК молекулата ја стопираат прогресијата на репликационата вилушка, поради што ДНК полимеразите и асоцираните протеини ја напуштаат вилушката.[4]

Процесирање на Оказаки фрагментите[уреди | уреди извор]

Отстранувањето на РНК прајмерите на Oказаки фрагментите е значаен чекор во репликацијата на ДНК. Повеќето вакви прајмери ги отстрануваат ендонуклеази од фамилијата RNase H.[4]

Поправка на несовпаѓање во базните парови[уреди | уреди извор]

Поправката на неусогласени базни парови ја вршат група на посебни ендонуклеази. Кај прокариотите, оваа улога најчесто ја вршат MutSLH системот и VSP системот.

Поправка со ексцизија на бази[уреди | уреди извор]

АП местата (апурински/апиримидински места) се честа појава кај ДНК. Тие се резултат на спонтана хидролиза на нуклеотидите или на активноста на ДНК гликозилазите во процесот на поправка со екцизија на бази. Овие АП места биваат отстранети од страна на АП ендонуклеазите.[4]

Поправка со ексцизија на нуклеотиди[уреди | уреди извор]

Поправката со ексцизија на нуклеотиди вклучува отстранување и замена на оштетените нуклеотиди. Кратки секвенци на едноверижна ДНК кои содржат оштетени нуклеотиди биваат отстранети со помош на посебни ендонуклеази кои сечат возводно и низводно од оштетеното место.

Поправка на пресеци во двојната верига[уреди | уреди извор]

Пресеците на двојната верига, без разлика дали се намерни или случајни, редовно се случуваат во клетките. Случајните пресеци најчесто се генерирани од страна на јонизирачко зрачење, разни егзогени или ендогени хемиски агенси и стопирани репликациони вилушки. Намерните пресеци се создаваат како интермедиери во процесот на мејоза и V(D)J рекомбинација, кои најчесто се поправаат преку хомологна рекомбинација и нехомологно поврзување на краевите. И во двата случаи потребно е краевите на пресеците на двојната верига да бидат процесирани од нуклеази пред да започне процесот на поправка. Една таква нуклеаза е Mre11 комплексирана со Rad50.[6]

Наводи[уреди | уреди извор]

  1. Nishino, Tatsuya; Morikawa, Kosuke (2002). "Structure and function of nucleases in DNA repair: shape, grip and blade of the DNA scissors". Oncogene. 21 (58): 9022–9032. doi:10.1038/sj.onc.1206135. PMID 12483517.
  2. 2,0 2,1 Rittié, Laure; Perbal, Bernard (2008). "Enzymes used in molecular biology: a useful guide". Journal of Cell Communication and Signaling. 2 (1): 25–45. doi:10.1007/s12079-008-0026-2. PMC 2570007. PMID 18766469.
  3. 3,0 3,1 3,2 Nishino, Tatsuya; Morikawa, Kosuke (2002). "Structure and function of nucleases in DNA repair: shape, grip and blade of the DNA scissors". Oncogene. 21 (58): 9027–9028. doi:10.1038/sj.onc.1206135. PMID 12483517.
  4. 4,0 4,1 4,2 4,3 Nishino, Tatsuya; Morikawa, Kosuke (2002). "Structure and function of nucleases in DNA repair: shape, grip and blade of the DNA scissors". Oncogene. 21 (58): 9022–32. doi:10.1038/sj.onc.1206135. PMID 12483517.
  5. Nishino, Tatsuya; Morikawa, Kosuke (2002). "Structure and function of nucleases in DNA repair: shape, grip and blade of the DNA scissors". Oncogene. 21 (58): 9022, 9023. doi:10.1038/sj.onc.1206135. PMID 12483517.
  6. Nishino, Tatsuya; Morikawa, Kosuke (2002). "Structure and function of nucleases in DNA repair: shape, grip and blade of the DNA scissors". Oncogene. 21 (58): 9024, 9025. doi:10.1038/sj.onc.1206135. PMID 12483517.

Надворешни врски[уреди | уреди извор]