ДНК микрочип

Од Википедија — слободната енциклопедија
Прејди на прегледникот Прејди на пребарувањето
Преглед на ДНК микрочиповите. Во организмот, гените се транскрибираат, а потоа со сплајсинг се добиваат зрели иРНК молекули (црвено). Потоа молекулите на иРНК се екстрахираат од организмот и со помош на реверзната транскриптаза се претвораат во дв-кДНК (сино). Во микрочипот, дв-кДНК се фрагментираат и се обележуваат со одредена флуоресцентна супстанца (портокалово). Обележаните фрагменти се врзуваат за правилно поредени низи на комплементарни олигонуклеотиди со познати секвенци. Мерењето на интензитетот на флуоресценција низ низата го покажува бројот на олигонуклеотидните секвенци кои биле врзани. Овие секвенци се специјално избрани да детектираат одделни гени од интерес во геномот на дадениот организам.

ДНК микрочипот (исто така познат како биочип) е колекција на кратки ДНК молекули (олигонуклеотиди) врзани за цврста подлога.[1][2] Се користи во молекуларната биологија за мерење на нивото на експресија на голем број на гени одеднаш или, пак, за генотипизација на повеќе региони на одреден геном. Секое место (точка) на врзување на ДНК молекула содржи пикомоли (10-12 мола) од специфична ДНК секвенца, позната како проба (или репортер или олиго). Таа може да биде краток сегмент од одреден ген или, пак, некој друг ДНК елемент, а служи да врзе (хибридизира) соодветна кДНК (комплементарна ДНК) или кРНК (комплементарна РНК) молекула (наречена таргет) под одредени услови. Хибридизацијата помеѓу пробата и таргетот обично се детектира и се мери со користење на таргети обележани со флуорофорисребро или хемолуминисцентна супстанца.[3] На овој начин се одредува релативната застапеност на одредени ДНК или РНК секвенци кај таргетот.

Најчесто употребувана техника за производство на ДНК микрочипови е фотолитографијата, кај која ДНК сегменти од гени со позната секвенца се синтетизираат директно на црвста подлога (најчесто стакло со тенок органски слој).[1]

Првите чипови на нуклеински киселини беа макрочипови, со димензии околу 9 cm x 12 cm, а првата анализа на компјутеризирана слика добиена од макрочип беше објавена во 1981 година.[4]

Принцип[уреди | уреди извор]

Главниот принцип на функционирање на ДНК микрочиповите е хибридизацијата помеѓу две ДНК нишки, што претставува способност на ДНК секвенците да се врзуваат меѓусебе со помош на водородни врски кои се формираат помеѓу комплементарните базни парови.

Голем број на комплементарни базни парови во одредена олигонуклеотидна секвенца води до појако нековалентно (електростатско) врзување меѓу двете нишки.

По измивањето на неспецифично врзаните секвенци, само јако-врзаните секвенци ќе останат во хибридизирана состојба. Флуоресцентно-обележаните таргет секвенци кои се врзуваат за секвенците на пробите создаваат сигнал чиј интензитет зависи од условите на хибридизацијата, како што е температурата, и процесот на миење по хибридизацијата. Вкупната јачина на сигналот од одредено место (или точка, анг. feature) зависи од количината на таргетните секвенци, од примерокот, кои успешно се врзале за пробите присутни на тоа место. ДНК микрочиповите користат релативна квантификација, кај која интензитетот на одредена точка се споредува со интезитетот на истата точка но под други услови, а идентитетот на точката е одреден со нејзината локација односно позиција на површината на чипот.

Одделните чекори во експеримент во кој се користи ДНК микрочип.
Хибридизација на таргетот за пробата.

Употреба и типови[уреди | уреди извор]

Два Affymetrix микрочипови.  Кибритчето доле лево  се користи за споредба  на големина.

Постојат многу типови на микрочипови, а особината по која најмногу се разликуваат е дали просторно се распоредени на површина или на кодирани перли:

  • Традиционалниот чип со цврста фаза е колекција на правилно распоредени микроскопски "точки" (анг. features), од кои секоја содржи илјадници идентични и специфични проби врзани за цврста површина, како стакло, пластика или силициумски биочип (познат како геномски чип, ДНК чип или генски чип). Илјадници вакви микроскопски "точки" можат да бидат поставени на познати локации на еден единствен ДНК микрочип.
  •  Алтернативниот микрочип со перли е колекција на микроскопски полистиренски перли (зрна), од кои секоја поседува специфична проба и сооднос на две или повеќе бои, кои не интерферираат со флуоресцентните бои кои се врзуваат за таргет секвенците.

ДНК микрочиповите може да се користат за детекција на ДНК молекули (како во компаративната геномска хибридизација) или за детекција на РНК молекули (најчесто како кДНК, по реверзна транскрипција) кои можат или не можат да се транслатираат во протеини. Процесот на мерење на генската експресија преку кДНК се нарекува анализа на експресијата или профилирање на експресијата.

Производство[уреди | уреди извор]

ДНК микрочиповите може да се произведуваат на различни начини, во зависност од бројот на пробите, барањата за прилагодување и видот на научното прашање кое се поставува. ДНК микрочиповите од комерцијалните продавачи може да имаат број на проби кој варира од 10 па се до 5 милиони или повеќе.

Точкести и in situ синтетизирани микрочипови[уреди | уреди извор]

ДНК микрочиповите може да се произведат со користење на различни технологии, вклучувајќи печатење со фини пинови врз стаклени слајдови; фотолитографија која користи претходно изработени маски; фотолитографија која користи динамички микроогледални уреди; инк-џет печатење;[5] или електрохемиски на микроелектрични чипови.

Кај точкестите ДНК микрочипови, пробите се олигонуклеотиди, кДНК или мали фрагменти од PCR-производи кои одговараат на иРНК (информациона РНК). Пробите се синтетизираат пред нивно врзување за површината на микрочипот, кое се прави така што се распределуваат на одделни точки. Многу чест пристап за исполнување на оваа цел е употреба на низи од многу фини игли, или игли кои се контролирани од роботска рака која вади примерок на раствор што содржи ДНК проби, а потоа го депонира на одредени локации на површината на ДНК микрочипот. Резултирачката "мрежа" на проби ги претставува профилите на нуклеинската киселина на подготвените проби и на овој начин е подготвена да прими комплементарни кДНК или кРНК таргети добиени од експериментални или клинички примероци. Оваа техника се користи за производство на ДНК микрочипови во склоп на самата истражувачка лабораторија каде ќе биде употребен микрочипот. Вака добиените микрочипови можат лесно да се прилагодат за посебните потреби или услови кои се бараат при изведување на експериментот. Во вакви случаи, истражувачите самите ги бираат пробите и нивните локации за печатење на микрочипот, самите ги синтетизираат пробите во својата лабораторија и ги нанесуваат на микрочипот. Ваквата практика резултира со релативно ниски цени за добивање на микрочиповите, кои можат да се прилагодат за потребите на секој одделен експеримент, а на овој начин се избегнуваат трошоците за купување на често поскапите комерцијални ДНК микрочипови, кои може да содржат огромен број на гени кои не се од интерес за истражувачот.

Кај олигонуклеотидните ДНК микрочипови, пробите се кратки секвенци дизајнирани да одговараат на делови од секвенците на познати или предвидени отворени рамки за читање (анг. open reading frame - ORF). Иако олигонуклеотидни проби често се користат и кај точкестите ДНК микрочипови, терминот "олигонуклеотиден ДНК микрочип" најчесто се однесува на специфичната техника на нивно производство. Олигонуклеотидните ДНК микрочипови се произведуваат со синтетизирање на секоја одделна секвенца директно на површината на микрочипот (in situ), наместо да се врзуваат веќе синтетизирани секвенци, како кај точкестите ДНК микрочипови. Секвенците можат да бидат подолги (60-нуклеотидни проби, како што е Agilent дизајнот) или пократки (25-нуклеотидни проби, произведени од Affymetrix) зависно од целта; подолгите проби се поспецифични за таргетот, додека пократките проби можат погусто да се нанесат на површината на микрочипот и се поефтини за производство. Една од техниките за производство на олигонуклеотидни ДНК микрочипови е фотолитографска синтеза (Affymetrix) на супстрат од силициум, каде се користи светлина и фотосензитивни маскирачки агенси за "изградба" на секвенцата, нуклеотид-по-нуклеотид.[6] Секоја проба, која треба да се нанесе, селективно се "демаскира" пред вронување на микрочипот во раствор кој содржи еден вид на нуклеотид, потоа се врши реакција на "маскирање", па следните проби повторно се демаскираат во подготовка за вронување на микрочипот во раствор на друг нуклеотид. После одреден број повторувања на постапката, секвенците на секоја проба се целосно синтетизирани. Развиена е и метода на синтеза на пробите без употреба на реакции на маскирање.[7]

Двоканална и едноканална детекција[уреди | уреди извор]

Шема на типичен експеримент со ДНК микрочип.

Двобојните ДНК микрочипови или двоканалните ДНК микрочипови обично се хибридизираат со кДНК подготвена од два примерока кои треба да се споредат (на пример, заболено ткиво во споредба со здраво ткиво) и кои се обележани со два различни флуорофора.[8] Флуоресцентните бои кои најчесто се користат за означување на кДНК се Cy3, кој емитира на бранова должина од 570 nm (што одговара на зелениот дел од спектарот) и Cy5, кој емитира на бранова должина од 670 nm (што одговара на црвениот дел од спектарот). Двата Cy-обележани примероци од кДНК се мешаат и хибридизираат во еден ДНК микрочип, кој потоа се скенира за да се визуелизира флуоресценцијата на двата флуорофора по ексцитација со ласерски зрак со дефинирана бранова должина. Релативните интензитети на секој флуорофор потоа се користат во анализа базирана на сооднос за да се идентификуваат нагорно-регулираните и надолно-регулираните гени.[9]

Олигонуклеотидните ДНК микрочипови често имаат контролни проби дизајнирани да се хибридизираат со RNA spike-ins (кратки синтетски РНК полимери). Степенот на хибридизација помеѓу RNA spike-ins и контролните проби се користи за нормализирање на мерењето на хибридизацијата за целните проби. Иако апсолутните нивоа на генска експресија може да се одредат, во ретки случаи, во двобојниот ДНК микрочип, релативните разлики на генската експресија помеѓу различните точки во примерокот и помеѓу различни примероци е преферираниот метод на анализа на податоци за системот со две бои. Примери за снабдувачи на такви ДНК микрочипови се: Agilent со нивната Dual-Mode платформа, Eppendorf со нивната DualChip платформа за колориметриско Silverquant обележување и TeleChem International со Arrayit.

Во едноканалните ДНК микрочипови или еднобојните ДНК микрочипови, чиповите даваат податоци за интензитетот на секоја проба или група на проби, што означува релативно ниво на хибридизација со обележаниот таргет. Меѓутоа, тие не покажуваат нивоа на застапеност на одреден ген, туку релативна застапеност, кога се споредуваат со други примероци испитувани со истиот експеримент. Секоја одделна РНК молекула подлежи на разликите во протоколите и сериите за време на фазите на амплификација, обележување и хибридизација, што ги прави споредбите помеѓу гените за истиот ДНК микрочип неинформативни. Споредбата на две различни услови за истиот ген изискува две посебни еднобојни хибридизации. Неколку популарни едноканални системи се Affymetrix "Gene Chip", Illumina "Bead Chip", едноканалните ДНК микрочипови на Agilent, "CodeLink" ДНК микрочиповите на Applied Microarrays и "DualChip & Silverquant" микрочиповите на Eppendorf. Позитивната страна на системот на еднобојните ДНК микрочипови лежи во фактот што еден несоодветен примерок не може да влијае на податоците добиени од другите примероци, бидејќи секој чип е изложен само на еден примерок (за разлика од двобојниот систем, каде еден ниско-квалитетен примерок може драстично да влијае врз целокупната прецизност на податоците, дури и во случај другиот примерок да е со висок квалитет).

Наводи[уреди | уреди извор]

  1. 1,0 1,1 Nelson & Cox (2017). Lehninger Principles of Biochemistry 7th Edition. W. H. Freeman. стр. 341-342. ISBN 1464126119. 
  2. „DNA Microarray Technology“. National Human Genome Research Institute (NHGRI) (en-US). конс. 2018-03-12. 
  3. Glass slides to DNA microarrays (на en). „Materials Today“ том  7 (3): 20–26. 1 март 2004 г. doi:10.1016/S1369-7021(04)00122-1. ISSN 1369-7021. https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S1369702104001221. 
  4. TAUB, FLOYD, E.; FLOYD; TAUB, E.; DeLEO, JAMES M.; THOMPSON, E. BRAD (26 март 2009 г). Sequential Comparative Hybridizations Analyzed by Computerized Image Processing Can Identify and Quantitate Regulated RNAs (на EN). „DNA“ том  2 (4): 309–327. doi:10.1089/dna.1983.2.309. https://www.liebertpub.com/doi/abs/10.1089/dna.1983.2.309. 
  5. Lausted, Christopher; Dahl, Timothy; Warren, Charles; King, Kimberly; Smith, Kimberly; Johnson, Michael; Saleem, Ramsey; Aitchison, John; и др. (2004 г). POSaM: a fast, flexible, open-source, inkjet oligonucleotide synthesizer and microarrayer. „Genome Biology“ том  5 (8): R58. doi:10.1186/gb-2004-5-8-r58. ISSN 1474-760X. PMID 15287980. https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/15287980. 
  6. Pease, A. C.; Solas, D.; Sullivan, E. J.; Cronin, M. T.; Holmes, C. P.; Fodor, S. P. (24 мај 1994 г). Light-generated oligonucleotide arrays for rapid DNA sequence analysis. „Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America“ том  91 (11): 5022–5026. ISSN 0027-8424. PMID 8197176. https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/8197176. 
  7. Nuwaysir, Emile F.; Huang, Wei; Albert, Thomas J.; Singh, Jaz; Nuwaysir, Kate; Pitas, Alan; Richmond, Todd; Gorski, Tom; и др. (ноември 2002 г). Gene expression analysis using oligonucleotide arrays produced by maskless photolithography. „Genome Research“ том  12 (11): 1749–1755. doi:10.1101/gr.362402. ISSN 1088-9051. PMID 12421762. https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/12421762. 
  8. Shalon, D.; Smith, S. J.; Brown, P. O. (јули 1996 г). A DNA microarray system for analyzing complex DNA samples using two-color fluorescent probe hybridization. „Genome Research“ том  6 (7): 639–645. ISSN 1088-9051. PMID 8796352. https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/8796352. 
  9. Tang, Thomas; François, Nicolas; Glatigny, Annie; Agier, Nicolas; Mucchielli, Marie-Hélène; Aggerbeck, Lawrence; Delacroix, Hervé (15 октомври 2007 г). Expression ratio evaluation in two-colour microarray experiments is significantly improved by correcting image misalignment. „Bioinformatics (Oxford, England)“ том  23 (20): 2686–2691. doi:10.1093/bioinformatics/btm399. ISSN 1367-4811. PMID 17698492. https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/17698492. 

Надворешни врски[уреди | уреди извор]